¿Cómo elegir un microscopio?

Como los microscopios (y sus primas hermanas: las lupas estereoscópicas) son instrumentos ópticos de precisión con un costo que no es menor, creemos que es muy importante que elijas bien qué modelo comprar para que no sufras decepciones con su desempeño pero que tampoco gastes dinero de más, pagando por prestaciones que en realidad jamás pensaste usar.

Para el ojo entrenado, es posible extraer conclusiones muy claras a partir de las hojas de especificaciones técnicas de los equipos que se están evaluando pero, para una buena parte de nuestros clientes, estos datos resultan difíciles de interpretar y muchas veces terminan eligiendo un equipo por cuestiones de marca, precio, referfencias -a veces muy certeras y otras veces difusas-, opiniones de vendedores -a veces honestas, a veces interesadas-, etc.

En esta página nos proponemos abordar los aspectos que consideramos clave y de una manera que aún los interesados más inexpertos puedan interpretar.

Los microscopios proporcionan un gran aumento. La mayoría amplían el objeto bajo estudio desde 40 hasta 1000 veces, y a veces un poco más -de manera un tanto mentirosa- pero este gran aumento tiene algunas desventajas:

A menos que se usen microscopios especiales, la luz tiene que atravesar lo que se quiere ver y por eso:

• El espécimen no puede ser opaco
• Hay que cortarlo en rebanadas muy finitas y encerrar cada una entre dos placas de vidrio también muy finitas (portaobjeto y cubreobjeto)
• Algunos espécimenes son demasiado traslúcidos y para verlos bien hace falta teñirlos o usar técnicas especiales (que revisaremos más abajo)

Al ser tan grande el aumento, verás sólo una parte muy pequeña de la muestra y es posible que te resulte difícil reconocer lo que se observa como una parte del todo

Salvo seres muy pequeños, en general no podrás ver nada que esté vivo.

Ni soñar con ver una hormiga, una hebra de tela, una firma en un papel, la rotura de una pieza, una punta de flecha o un grano de arena.

Si querés ver con aumentos, pero sin hacer preparados, sin precisar que el objeto sea transparente, sin matarlo y cortarlo en rebanadas, si te interesa ver su comportamiento y/o querés reconocer el aspecto general de lo que estás viendo te convendrá en cambio elegir una lupa estereoscópica (que además es más económica).

En otras épocas se supieron fabricar microscopios monoculares (con un solo ocular) de calidad profesional. Hoy en día esta categoría está reservada a equipos de hobby o a los compradores que buscan el precio más bajo y nada más. Los resultados son muy a menudo decepcionantes y no te aconsejamos esta clase de equipos.

El tipo de microscopio más común es el binocular (con dos oculares), resulta cómodo para trabajar y, ya que se trata de un equipo un poco más caro, el resto de los componentes suele se de mejor calidad. Si más adelante se desea equipar uno de estos instrumentos con una cámara para poder fotografiar, filmar, medir y compartir en vivo lo que estás viendo con varios alumnos o colegas, podrás agregar alguna cámara básica u ocular digital, pero el trabajo se hace un poco más incómodo, porque queda anulado un ocular.

Si creés que en algún momento querrás acoplar una cámara, te recomendamos calurosamente un microscopio trinocular (con dos oculares propiamente dichos y una tercera salida en la que se puede acoplar una cámara a través de un adaptador). En general, la diferencia de precios entre modelos binoculares y trinoculares con el resto de sus características equivalentes no es demasiado grande (va del 10 al 15 por ciento) y deja las puertas abiertas para crecer sin dolores más adelante.

En lo posible, conviene elegir equipos cuya 3a salida (salida "trinocular") sea del tipo estándar ISO, con lo que se garantiza que podrás agregar adaptadores y cámaras de la marca y modelo que desees, sin quedar pegad@ a un ecosistema de accesorios propietario donde muchas fábricas aplican márgenes bastante más grandes que en los equipos de base.

Hoy en día todos los microscopios y lupas se ofrecen con oculares de campo amplio (Wide Field) y 10 aumentos.
Si el ocular es de campo amplio, uno mira la muestra a través de una ventana, y con uno que no lo es, a través de una cerradura.

Pero no todos los campos amplios son iguales: algunos oculares de los microscopios más modestos, pero aceptables, ofrecen una ventana de 18 mm, los buenos andan por los 20 y los de alta gama suelen ofrecer 22 o 23 mm.

Crear una imagen buena en un campo más grande pone en exigencia al resto de los componentes ópticos del equipo, así que el dato del diámetro de la pupila del ocular, que normalmente se toma como algo menor, en realidad da una muy buena pista de la performance y cuidado en el diseño del resto del equipo.

Algunos equipos, especialmente los más rudimentarios, se ofrecen con oculares de más aumentos (p. ej 16X o 20X) pero, en nuestra experiencia, esta promesa de mayor aumento decepciona por dos motivos: la apertura (el tamaño de la ventana) se hace más chica y no se agrega resolución (detalle) a lo que se observa: se ve lo mismo pero más grande. Es como hacerle zoom a un jpg de baja resolución.

Si usás anteojos, te convendrá asegurarte de que el portaoculares permita ajustar la posición de enfoque de al menos uno de los oculares porque tus anteojos, al corregir la miopía o hipermetropía, cambián también la posición del plano de enfoque de tu ojo y el microscopio deberá poder acompañarlo. Otro tema que se suele nombrar en las especificaciones es un punto alto de enfoque, que quiere decir simplemente que no precisás tener tus ojos tan pegados a los oculares, sino que los podés retirar un poco, lo que es mucho más cómodo, sobre todo para trabajos prolongados.

Ninguna es intrínsecamente mejor, pero la óptica infinita permite insertar accesorios en el camino óptico (como el relleno de un sandwich) sin alterar los aumentos, condiciones de enfoque y demás.

Si no tenés planeado agregar más adelante un epi iluminador, un analizador avanzado de polarización o alguna otra cosa por el estilo, un equipo con óptica conjugada (la que se dá por sentado y casi nunca se aclara explícitamente en las especificaciones) estará bien y te costará menos.

La óptica infinta (corregida a infinito) generalmente cuesta un poco más y se reserva para equipos de las gamas media alta y alta.

Las lentes que forman parte de un microscopio están hechas con vidrio, y el vidrio (así como la mayoría de las sustancias transparentes, aún tu critalino) no trata por igual a todas las longitudes de onda (los colores).

La consecuencia es que los distintos colores de la luz que viene del espécimen se enfocan en planos diferentes, si uno enfoca el rojo, el verde queda desenfocado y el azul más aún.

Este efecto se nota especialmente en los bordes, que se difuminan y observan como un pequeño arco iris.

En cualquier microscopio que no sea de juguete o hobby, este problema es tenido en cuenta y las ópticas se construyen de tal manera que los efectos indeseados de los varios lentes del sistema óptico se compensen y cancelen entre sí, al menos para los colores que van del rojo al verde. Esta es la corrección más modesta a la que se puede aspirar y los equipos se especifican como de óptica acromática.

Si tenés uno de estos equipos y querés llevar un poco más lejos la corrección (renunciando a los colores naturales) podés interponer un filtro verde en el sistema de iluminación, con lo que el rojo no molestará porque ni siquiera estará presente.

Que no haya halos de colores no quiere decir que toda la imagen esté en foco. Cuando se especifica óptica acromática, lo normal será que el 60 o 65% del campo esté en foco y que luego este se vaya perdiendo gradualmente hacia los bordes.

Implementando correcciones adicionales, se puede lograr que aproximadamente 4/5 del campo esté en foco, en lo que se conoce como óptica semiplana.

Haciendo un esfuerzo extra se consigue que el 95% de campo esté en foco, en lo que se conoce como óptica plana.

Cada paso exige, en general, agregar alguna otra lente al sistema óptico, pero existe claramente un límite para este procedimiento.

Para seguir mejorando la calidad de la imagen sin agregar más elementos se puede cambiar la estrategia y, en lugar de usar lentes desbastadas y pulidas como cascos de esferas (que es lo más común y económico), se pueden diseñar y tallar lentes de formas especiales (no esféricas) que se llaman asféricas. Estas lentes tienen muy buen desempeño pero su costo es muchas veces superior al de las anteriores, y su uso se reserva exclusivamente a equipos de alta gama.

Existe un tipo de óptica, con una definición un tanto difusa -más bien cuali que cuantitativa- que se llama apocromática o APO que quiere decir que manejan muy bien los colores de todo el rango visible y que producen imágenes de alta calidad, sin entrar en más detalles. Su uso también está reservado a equipos de alta gama.

Cada vez que la luz llega a la frontera que separa dos superficies transparentes (aire-lente o lente-lente) se produce una reflexión que no es menor (aproximadamente un 4% en el mejor de los casos).

Esta reflexión tiene dos consecuencias: queda menos luz disponible para formar la imagen y además se iluminan lugares que uno no desea, generando un fondo blanquecino (contraste pobre) y/o brillos extraños (artefactos ópticos).

Sin embargo, no todo está perdido: haciendo una deposición controlada y muy precisa de delgadas capas sobre cada elemento óptico, es posible crear "antirreflexiones" (perdón por el nombre inventado) que cancelan las reflexiones indeseadas. Una de estas capas puede cancelar bien la reflexión de un color, pero no de otros, y entonces se recurre a un esquema con múltiples capas de "antirréflex", para conseguir el efecto sobre más y más colores. Cuantas más capas se usen (y más inteligente sea su diseño, muy similar al de los filtros pasabandas de la electrónica) mejor será el efecto: la imagen tendrá mejor constraste y colores más realistas e intensos.

Aquí está uno de los secretos del cheff de muchas fábricas de microscopios de primera línea y, en lugar de dar una especificación técnica concreta de cómo se comportan, bautizan sus ópticas con distintos nombres de fantasía: Enhanced Contrast EC, High Contrast HC, Super Contrast SC, Ultra Constrast UC, etc. Dentro de la misma marca es fácil decir cuál es la mejor, por su costo. Pero al comparar entre marcas, esto se vuelve mucho más difícil y sólo lo resolvería una comparación directa.

Dicho lo anterior: antes de embarcarte en un gasto grande con una súper óptica, te convendrá considerar primero si realmente el tipo de observación que tenés pensado hacer lo precisa y tener muy presente que la mejor óptica te dará un resultado muy pobre si no ajustás bien el sistema de iluminación.

Los objetivos son una pieza clave de los microscopios.

Se encargan del trabajo más difícil haciendo la primera magnificación, en la que se define el nivel de detalle (definición) con que se podrá ver la imagen. Los detalles que no detecten los objetivos, no podrán ser rescatados o reinventados por los oculares, por más aumentos extra que estos apliquen después.

La magnificación (o aumento) es simplemente el cociente entre el tamaño de la imagen creada por un sistema óptico y el tamaño del que se partió.

Intuitivamente sabrás a qué nos referimos con definición, pero conviene darle una definición más formal y fácill de compartir y comparar.

Digamos que el espécimen es un objeto muy simple formado por dos puntos. Si uno los mira con el microscopio debería ver, justamente, dos puntos. Si estos puntos comienzan a aproximarse seguirán siendo objetos individuales. Pero mucho antes de que se toquen en el mundo real se confundirán en la imagen que observás de ellos en el microscopio, quedando "pegados". A la distancia más pequeña a la que se pueden poner dos puntos en el mundo real sin que sus imagenes se "peguen" en el microscopio se la llama resolución espacial y esta es claramente más importante que sus aumentos en bruto.

La explicación completa de por qué no es posible obtener una definición tan buena como uno quiera escapa al cometido de esta guía, pero el hecho físico subyacente es que la luz en realidad no está formada por pequeños rayos unidimensionales, sino que es un proceso ondulatorio que precisa una cierta región del espacio par desarrollarse. Las fotos que están en WA-9899 pueden darte una idea de la situación.

El hecho importante es que que la definición está estrechamente ligada a la apertura numérica (A.N. o N.A. en los folletos en Inglés) y cuanto más grande es el valor de la apertura numérica, mejor es la resolución. En cualquier caso, la distancia más pequeña que podrá ser resuelta nunca será menor que 0,61 x longitud de onda de la luz utilizada / Apertura Numérica

El valor de AN está indicado en los folletos de todos los microscopios (y hasta en el marcado de los propios oculares) con una barra después del aumento. . P. ej.: parte del folleto del Panthera L muestra: Objetivos Planacromáticos UC (Ultra Contraste): 4X/0,1; 10X/0,25; 40X/0,65/R; 100X/1,25/R-Aceite. Aquí los valores de apertura numérica son 0,1; 0,25; 0,65 y 1,25 respectivamente.

Los objetivos de gran aumento (y gran apertura numérica), típicamente los de 100 X, precisan que se rellene el espacio entre ellos y la muestra con una minúscula gota de aceite de inmersión (p. ej. el 1101001300011)

Aunque a primera vista parece que bastaría con que la iluminación del espécimen sea intensa y pareja (lo que puede conseguir fácilmente con una buena lámpara y un vidrio esmerilado) en realidad la cosa no es tan sencilla: el sistema de iluminación tiene una inesperada incidencia en el contraste y resolución de lo que se observa y su implementación es más compleja.

Por una parte, para obtener el máximo contraste, conviene que se ilumine exclusivamente la parte de la muestra que se está observando (como si fuera con un spot seguidor en un teatro) y ninguna cosa más. Toda la luz que esté presente y que no esté siendo transmitida a través de la delgada feta de la muestra, no solo no contribuirá en nada al resultado final, sino que creará un fondo blanquecino, que la hará ver lavada, sin contraste.

El enfoque requerido se consigue con un condensador (el condensador de Abbe) que tiene dos ajustes: uno de altura para enfocarlo, y otro con un diafragma, que simultáneamente regula la cantidad y el ángulo del cono de luz con que se acomete la muestra. El correcto ajuste de estos dos parámetros tiene una incidencia notabilísima sobre el contraste de la imagen, también en su resolución, y lo más común es que se busque conseguir la iluminación crítica o de máximo contraste.

En los equipos de gama media alta y alta, se agrega otro punto de ajuste más en la base del estativo, con el que se puede conseguir la iluminación según Koehler. Con Koehler se sacrifica un poco de contraste pero se consigue el mayor nivel de detalle (resolución espacial) que puede ofrecer un microscopio determinado.

En cualquiera de los 2 casos, deberás ajustar el sistema de iluminación cada vez que cambies de objetivo (p. ej. de 10 a 40 X)

La luminaria propiamente dicha puede ser una lámpara de filamento común, una lámpara halógena o un LED.

Salvo aplicaciones especiales, como el análisis petrográfico, la iluminación con los LEDs actuales resulta la más conveniente, porque tienen una vida útil muchísimo mayor, no cambian de color cuando se ajusta su intensidad y gastan menos energía eléctrica.

Mientras que los primeros LEDs blancos manejaban potencias del orden de 0,1 W, los actuales manejan normalmente 1 W o 3 W y por eso se los llama a veces Power LED.

Algunos equipos de alta gama, como el Panthera L incluyen 2 cartuchos de iluminación intercambiables: uno con lámpara halógena y otro con LED, para brindar la máxima flexibilidad a los usuarios. Otros de gama media-alta, aceptan el cambio de cartuchos, pero vienen equipados con uno solo (generalmente LED).

El modo más común es el que se llama de campo claro, en el que el espécimen se observa sobre un fondo claro (blanco).

Existen otras maneras de iluminar que responden a necesidades especiales.

Algunas son de implementación muy sencilla (p. ej. campo oscuro) y se podrán agregar a casi cualquier microscopio.

Otras son notablemente más sofisticadas y no cualquier microscopio está preparado para recibirlas.

Por ejemplo: si pedís un microscopio que sea compatible con epifluorescencia, aunque no te compres los accesorios ya mismo, estarás incrementando el precio de lo que vas a comprar en no menos del 50%.

Por eso, te aconsejamos hacer una consideración muy realista de cuáles son tus necesidades de uso.

Los equipos con iluminación de campo oscuro interponen un obstáculo en el centro paso de iluminación, de tal manera que el espécimen es iluminado por la cáscara de un cono de luz, y no por un cono macizo.

Como resultado, se observa un fondo oscuro y la única luz que llega al objetivo es la que se dispersa en los bordes de los elementos bajo estudio.

Resulta particularmente útil para enfatizar las estructuras de los bordes, paredes celulares, cilias, etc.

Si una estructura es perfectamente transparente, no resultará posible verla ni con campo claro ni con campo oscuro.

Pero no todo está perdido. Las cosas transparentes también afectan el paso de la luz, sólo que de una manera más sutil, haciendo que solo que disminuya su velocidad.

Con un truco ingenioso se puede aprovechar este efecto para tornar visible lo que de otra manera sería indetectable. El mismo consiste en hacer llegar al ojo del observador dos frentes de ondas: uno que viene directamente desde la fuente de iluminación y otro que ha pasado a través del objeto transparente. Según el índice de refracción y el espesor de la estructura transparente, en algunos casos los 2 frentes de onda sumarán sus efectos, y en otros trabajarán en oposición, contrarrestándose. El resultado se manifestará como cambios de brillo que denotarán la presencia de la estructura.

Esta técnica ofrece una representación del espécimen, que seguramente coincidirá con la forma general de su planta y permitirá develar muchos de sus detalles, pero no será una figura "realista"

Se usa fundamentalmente para estudiar espécimenes vivos, secciones delgadas y estructuras inestables.

Para implementarla, debe modificarse o reemplazarse el condensador y alguno/s de los objetivos. Aunque no es imprescindible, también resulta muy cómodo adquirir también una especie de ocular especial que se llama telescopio de centrado fases.

En términos muy generales, el kit de contraste de fases suele costar tanto como el resto del microscopio.

Hay sustancias, particularmente las cristalinas, que tienen la propiedad de girar el plano de polarización de la luz que pasa a través de ellas.

Este giro, no necesariamente tiene que ser igual para todas las longitudes de onda. Es más, en general no lo es, y la manera en que se afectan distintas longitudes de onda pueden dar pistas muy concretas sobre la composición del un determinado mineral, la presencia de cristales de azúcar, la identificación de zonas con tensión mecánica, etc.

Para poner en evidencia la rotación del plano de polarización se hace pasar la luz del sistema de iluminación a través de un polarizador, que es simplemente una lámina que deja pasar selectivamente sólo los fotones que están polarizados de la misma manera. Luego de que la luz pasa a través de la muestra, se la hace atravesar una segunda lámina polarizadora que recibe el nombre de analizador.

En su ajuste más general, con la platina vacía se cruzan los dos polarizadores a 90 grados, produciendo una extinción casi total de la luz que llega al objetivo. Luego se inserta la muestra y, si alguna parte de la misma giró de alguna manera el plano de polarización de la luz de alguno de los colores presentes, este aparecerá de de manera brillante y notoria en la imagen formada.

Si se analizan minerales, aunque es posible crear la iluminación original con un LED, en general se prefiere hacerlo con una lámpara halógena, lo que permite identificar varios tipos de mineral directamente por su color a través de la carta de Michel-Levy.

La mayoría de las sustancias, cuando reciben una radiación luminosa, la absorben y/o dejan pasar y/o reflejan y/o dispersan y nada más.

Esto ya es bastante, pero algunas hacen algo más: absorben la energía de fotones de determinadas longitudes de onda, y un corto tiempo después devuelven parte de la energía que tomaron en un fotón de longitud de onda mayor, en un proceso que se llama fluorescencia.

Los microscopios pueden aprovechar este fenómeno para detectar la presencia de sustancias muy específicas o estructuras que son afines con una determinada tintura fluorescente, en un proceso por el cual se ilumina la muestra con una longitud de onda corta (longitud de onda de excitación), se bloquea el paso de esta longitud de onda al observador para que no lo dañe ni deslumbre con un filtro de bloqueo y se recoge la reemisión esperada en una longitud de onda más larga con un filtro de paso. Estos 3 elementos de filtrado se alojan comunmente en un cubo o cargador de filtros.

Las ondas de excitación se situaron tradicionalmente en el ultravioleta y se las produjo casi siempre con lámparas de descarga de mercurio, pero los avances en el preparado de tinturas fluorescentes y la aparición de nuevos emisores de LED han desplazado la banda hacia longitudes de ondas más largas e inocuas, como el violeta, el azul y aún el verde.

El costo del kit de epifluorescencia es considerable, y normalmente es mayor que el del resto del microscopio y, si bien no es imprescindible, te resultará muy conveniente que el microscopio sea de óptica infiinta y no conjugada.

Si vas a querer registrar las imágenes de epifluorescencia, tené en cuenta que -en general- la luz de fluorescencia es muy tenue y precisarás una cámara de alta sensibilidad (p. ej. la MotiCAM S6)

 

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